（一）技术简介

长度长新生RNA测序是一种将严格新生RNA纯化与纳米孔直接RNA测序相结合的长读长新生RNA分析技术。它在单分子水平直接测定天然RNA分子的完整序列信息：每条read既携带RNA聚合酶II（Pol II）的实时转录位置（read 3′端），又完整记录该分子上每个内含子的剪接状态，从而在"转录正在发生的现场"直接观察RNA剪接的动力学、顺序与协同模式，是研究共转录RNA加工（剪接、3′端加工等）的独特工具。

（二）实验原理及流程

核心原理是"双重新生RNA富集 + 直接RNA测序"：

1. 双重新生RNA富集。新生RNA仅占细胞总RNA的不到0.5%，且成熟剪接RNA的微量污染就会高估共转录剪接水平。联合两种互补的富集策略可提高新生RNA纯度：①4-硫尿苷（4sU）代谢标记——细胞在含4sU的培养基中短期标记，4sU仅在标记窗口内掺入正在合成的新生RNA；②细胞分级分离——裂解细胞后经离心获得染色质组分，回收与染色质结合的、尚处于转录现场的RNA。随后对4sU进行生物素化反应，经链霉亲和素磁珠亲和选择获得4sU标记的染色质关联RNA（4sU-chr RNA）。

2. 3′端酶加尾及直接RNA测序。用大肠杆菌poly(A)聚合酶对纯化RNA的3′端进行体外酶加尾，连接测序接头并进行cDNA链合成（cDNA不测序，仅用于减少RNA二级结构、提高过孔通量），进行纳米孔测序。

实验流程：

1. 4sU代谢标记与收获：细胞在500 μM 4sU中脉冲标记8分钟，标记完成后立即收集细胞；

2. 细胞分级分离：低温条件下依次裂解细胞膜与核膜，经蔗糖垫离心分离细胞质、核质与染色质组分，回收染色质沉淀；

3. 染色质关联RNA提取：Qiazol法提取染色质组分RNA，DNase I处理去除基因组DNA；

4. 4sU生物素化与亲和选择：EZ-Link Biotin-HPDP标记4sU，经链霉亲和素磁珠选择、DTT洗脱，获得4sU标记新生RNA；

5. rRNA去除：RiboMinus去除核糖体RNA，避免rRNA reads占据纳米孔测序通量；

6. 3′端加尾：以E. coli poly(A)聚合酶加poly(A)尾，为新生RNA提供测序接头结合位点；

7. 接头连接与文库构建：连接splinted测序接头，cDNA链合成以减少RNA二级结构，RNAClean XP磁珠两轮纯化后上样；

8. 纳米孔测序与数据分析：MinION/PromethION测序，碱基识别后将RNA序列转换为DNA序列，以minimap2 -ax splice模式比对参考基因组，开展下游分析。

（三）分析内容

1. 编码基因表达分析及差异：对编码基因进行长reads计数与表达定量，分析样本间相关性，筛选组间差异表达基因并开展GO/KEGG功能富集分析；

2. 共转录剪接分析：基于已有内含子注释，在单分子水平判定每个内含子的剪接状态（已剪接/未剪接），绘制"转录-剪接距离"曲线（剪接完成时Pol II越过内含子3′剪接位点的距离），分析内含子对的剪接顺序，比较组成型剪接与可变剪接内含子的动力学差异；

（四）主要应用方向

1. 共转录剪接动力学研究：直接测量剪接完成与转录延伸的物理距离，解析转录与剪接的空间耦合关系；

2. 剪接顺序与协同性分析：判定多个内含子的剪接是否遵循转录顺序（"先到先剪"）或呈现既定顺序，揭示邻近内含子的协同剪接规律；

3. 可变剪接的共转录调控：分析可变剪接外显子邻近内含子的剪接时序差异，揭示可变剪接决策的时间窗口；

（五）技术优势

1. 直接RNA测序，无反转录、无PCR扩增：read序列即天然RNA分子，彻底避免cDNA文库制备的长度与剪接状态偏好；

2. 单分子多内含子异构体信息：单条read可跨越多个内含子，短读长测序无法实现的剪接顺序与协同性分析成为可能；

3. 双重新生RNA富集：4sU代谢标记+染色质分级分离联用，未剪接pre-mRNA富集效率显著高于任一单独方法，成熟RNA污染降至最低；

4. Pol II位置与剪接状态同步读取：单条read同时报告"转录到哪里"与"哪些内含子已剪接"，直接建立转录-剪接的物理关联；

（六）深碳优势

1. 实验流程自主研发，新生RNA双重富集体系稳定，有效捕获染色质关联新生RNA；

2. 纳米孔直接RNA测序平台运行经验丰富，从加尾、接头连接到流动芯片上样全流程质控；

3. 分析体系完善，涵盖编码基因表达与差异、共转录剪接动力学、剪接顺序与协同性等长读长特色分析内容；

4. 文章级全流程服务，包括一对一方案讨论及制定、检测数据解读、个性化分析、验证方案、审稿意见回复等。

（七）送样建议

a. 细胞样本经短暂4sU标记后立即收集，液氮速冻或直接进入分级分离流程，干冰寄送。

b. 不同类型样本推荐送样要求如下：

悬浮培养细胞系：≥1.0×10⁸  细胞

果蝇 S2 等半贴壁细胞：≥6.0×10⁸  细胞

贴壁培养细胞系：≥1.0×10⁸  细胞

（八）常见问题FAQ

Q1：长度长新生RNA测序能不能分析eRNA？

可以检测，但不是其主要优势项。eRNA（增强子RNA）具有三个特点：长度短（通常<500 nt）、不经poly(A)加尾、丰度低。纳米孔直接RNA测序对200 nt以下短reads的比对准确率有限，eRNA片段难以获得稳定可靠的定量结果。若您的关注点是增强子转录活性与eRNA，建议以PRO-seq/PRO-cap为主要手段（短读长、单碱基分辨率、增强子检测灵敏）。

Q2：长度长新生RNA测序与短读长新生RNA测序（如SLAM-seq、PRO-seq）的主要区别是什么？

PRO-seq/PRO-cap回答"聚合酶在哪里转录、从哪里起始"，SLAM-seq回答"RNA合成了多少、有多稳定"，长读长测序则回答"一条正在合成的新生RNA上，哪些内含子先剪、哪些后剪、剪接与转录离得多远"——单分子水平的RNA加工动力学是其不可替代的价值。

Q3：为什么必须使用直接RNA测序，而不是长读长cDNA测序？

长读长cDNA测序依赖模板转换型反转录，反转录必须到达RNA 5′末端才能完成，短而已剪接的分子远比长而未剪接的新生RNA更容易完成这一过程，导致cDNA文库系统性高估共转录剪接——在cDNA数据中，Pol II尚未越过3′剪接位点100 bp时就检测到大量"已剪接"信号，甚至出现剪接发生在Pol II占位区内（物理上不可能）的假象。直接RNA测序不经反转录与扩增，文库操作步骤最少，最大程度保留了新生RNA群体的真实剪接状态。

Q4：能实现单基因或单内含子分辨率的剪接分析吗？

受当前纳米孔测序通量限制，每个样本可获得约65万（MinION）至110万（PromethION）条唯一比对reads，单个基因中位仅覆盖1-7条reads，因此整体分析以全基因组聚合的方式呈现剪接的"平均动力学"；仅高表达基因可获得单基因水平的分析。

（一）基因差异表达分析

基于长reads唯一比对结果对编码基因进行表达定量，筛选组间差异表达基因（差异倍数与显著性双阈值），统计上下调基因数目，并以火山图直观展示差异基因的整体分布，为后续功能分析提供基因集合。

（二）GO/KEGG富集分析

对差异表达基因分别开展GO功能富集（生物过程BP、细胞组分CC、分子功能MF三个层级）与KEGG通路富集分析，以气泡图展示显著富集条目的基因数目与显著性，挖掘新生RNA层面差异基因所对应的生物学功能与信号通路变化。

（三）剪接动力学分析

基于内含子注释在单分子水平判定每个内含子的剪接状态，是长度长新生RNA测序最具特色的分析内容。核心结果包括：①剪接模式：将多内含子转录本根据内含子保留情况分为三类（全部剪接、部分剪接、全部未剪接），进行统计分析；

转录-剪接距离曲线——以Pol II越过内含子3′剪接位点后继续转录的距离为横轴、已剪接内含子比例为纵轴，量化剪接完成与转录延伸的物理距离；

剪接顺序分析——统计中间态内含子对中上游或下游内含子先剪接的比例；

剪接协同性分析——统计三条及以上连续内含子的剪接模式组合频率。

（四）可变剪接分析

将可变剪接分为4类，并统计每组样本中各种分类的数量，比较组间差异。

长读长新生RNA测序解析人与果蝇共转录剪接动力学与协同调控

期刊：Molecular Cell 

研究目的：酵母、动物体系已知 pre-mRNA 剪接大量发生在共转录阶段。传统短读新生转录技术仅能获得群体平均剪接效率，无法解析单分子层面多内含子的剪接组合、内含子移除先后顺序；cDNA长读文库存在逆转录偏倚，会丢失部分剪接中间体。本研究开发长读长直接 RNA 新生转录测序技术，对比人 K562、果蝇 S2 细胞，解析共转录剪接动力学模式、内含子剪接协同效应，揭示不同物种共转录剪接的分子差异。

实验设计：以人 K562 细胞、果蝇 S2 细胞为材料；4sU短脉冲标记活细胞新生 RNA，结合细胞组分分级分离富集染色质结合新生 RNA；人工 poly (I) 加尾，开展ONT 纳米孔直接 RNA 测序，规避 cDNA 逆转录扩增偏倚；设置 SF3B 复合体抑制剂 PlaB 药物扰动，抑制剪接体活性；生信层面基于基因注释 GTF，通过 read 的 CIGAR 信息判定每条单分子 read 各个内含子的剪接状态；计算剪接分数（splicing fraction），统计 Pol II 越过 3’剪接位点后不同延伸距离下的剪接完成比例；筛选同时覆盖多个内含子的 read 统计剪接顺序；联合 MaxEntScan 评估剪接位点强度对剪接动力学的影响。

主要结果：

1. 建立 nano-COP 技术捕获完整染色质结合新生 RNA 单分子；证实直接 RNA 测序显著优于 cDNA 建库，cDNA 文库会系统性丢失部分剪接中间体，高估剪接完成比例；可同时获取Pol II 位置（read 5’端）和整条 pre-mRNA 全部内含子剪接状态。

2. 揭示两套共转录剪接动力学模式：①即时剪接：Pol II 刚转录越过 3’剪接位点，尚处于下游外显子区间即完成剪接，对应内含子定义模式；②延迟剪接：Pol II 需要向下游转录数千 nt 距离之后才完成剪接，对应外显子定义模式。果蝇以即时剪接为主；人细胞大量基因表现延迟剪接。

3. 单分子水平解析内含子移除顺序：果蝇 S2 细胞内含子移除总体遵循 “先转录、先剪接”；人 K562 细胞大量单分子出现下游内含子先剪接、上游内含子保留的非顺序剪接现象，打破传统顺序剪接假说；邻近内含子之间存在剪接协同效应。

4. 剪接位点强度、基因结构显著影响共转录剪接动力学：强剪接位点更容易发生即时剪接；内含子长度会改变剪接发生的距离；可变剪接内含子整体共转录剪接效率低于组成型内含子。

5. PlaB 抑制 SF3B 剪接复合体后，人细胞全局共转录剪接效率显著下降；末端内含子大量在 Pol II 越过 polyA 位点之后才完成剪接，说明末端内含子很大一部分属于转录后剪接事件。

参考文献：

Drexler H L, Choquet K, Churchman L S. Splicing kinetics and coordination revealed by direct nascent RNA sequencing through nanopores[J]. Molecular Cell, 2020,77(5):985-998.e8