PRO-cap（Precision nuclear Run-On sequencing with Cap-selection，精密核运行加帽端测序）是一项以单碱基分辨率在全基因组范围内直接鉴定转录起始位点（TSS）的新生RNA测序技术。它与PRO-seq同期诞生于同一研究团队，二者共享核run-on实验体系，但"看点"互补：PRO-seq从新生RNA的3′端测序，定位RNA聚合酶的活性中心，回答"聚合酶正在哪里转录"；PRO-cap则从新生RNA的5′端测序，只捕获带有5′帽子结构的新生RNA，回答"转录从哪里开始"。PRO-cap让我们在RNA合成这一层面直接"看见"每一次转录的起点，是研究启动子使用、增强子起始的核心工具。
PRO-cap是一种基于核运行实验（Nuclear Run-On）的高通量测序技术。核心原理是：在细胞核被分离并洗去内源核苷酸、内源转录停止后，仍结合在DNA上的RNA聚合酶保持酶活性；此时外源添加生物素标记的核苷酸（Biotin-NTPs），活跃的聚合酶在新生RNA的3′端掺入1个（至多几个）生物素标记碱基后即停止延伸。利用链霉亲和素磁珠对生物素标记的新生RNA进行多轮严格亲和富集（累计约百万倍富集），可极大降低背景RNA干扰。
PRO-cap区别于PRO-seq的关键在于5′端的"加帽RNA选择"：新生RNA中只有正在启动转录的RNA带有5′帽子结构。通过5′-磷酸依赖性核酸外切酶降解带5′-单磷酸的未加帽RNA，再用碱性磷酸酶去除残余的5′-三磷酸/单磷酸，最后用TAP或RppH切除帽子结构、暴露5′-单磷酸，使5′测序接头只能连接到原本带帽的新生RNA上。测序从5′端进行，每个reads的5′端即精确对应一个转录起始位点（TSS）。
实验流程：
1. 样本准备与细胞核分离：在低温条件下分离完整细胞核，洗去内源核苷酸使转录停止，同时保留聚合酶活性，为核run-on反应提供稳定起始材料；
2. 核运行反应（Nuclear Run-on）：在分离的细胞核中加入Biotin-NTPs，活跃聚合酶将生物素标记核苷酸掺入新生RNA的3′端并随之终止延伸，完成新生RNA的原位标记；
3. RNA提取：提取总RNA，不经片段化处理，保留完整的新生RNA及其5′帽子结构；
4. 新生RNA富集①：利用链霉亲和素磁珠特异性富集带有生物素标记的新生RNA，经严格洗涤去除未标记RNA；
5. 3′接头连接与新生RNA富集②：在新生RNA 3′端连接测序接头，并再次通过生物素富集去除未连接接头的RNA；
6. 5′加帽RNA选择与去帽处理：依次用5′-磷酸依赖性核酸外切酶降解未加帽RNA、碱性磷酸酶去除残余5′-三磷酸/单磷酸、TAP/RppH去除帽子结构，确保5′接头只连接到带帽新生RNA上；
7. 5′接头连接与新生RNA富集③：连接5′测序接头，并进行第三轮生物素富集，获得两端均带有接头的加帽新生RNA；
8. 反转录与文库构建：反转录后先进行测试PCR确定最佳扩增循环数（避免过度扩增引入偏好），再进行文库PCR与PAGE胶回收；
9. 高通量测序与数据分析：哺乳动物细胞建议测序深度2,500万-5,000万条reads。将reads的5′端比对至参考基因组，生成链特异性的TSS信号图谱，开展TSS图谱、双向转录、启动子/增强子鉴别等分析。
1. 转录起始位点（TSS）图谱分析：通过peak calling在全基因组范围精确鉴定TSS，绘制启动子区域转录起始图谱，并对不同样本或处理组进行TSS活性定量与差异分析；
2. 可变TSS分析：同一个基因存在多个TSS时，分析不同TSS使用比例，以及处理条件下TSS转换情况；
3. 调控元件分析：基于TSS位点的链分布计算方向性评分（directionality score），区分单向主导转录的启动子与典型双向转录的活性增强子，注释增强子eRNA的精确起始位点，并分析不同处理组之间调控元件的活性差异；
4. Motif与网络分析：对差异TSS区域以及差异增强子区域进行转录因子motif富集分析，筛选具有调控关系的转录因子-调控元件、调控元件-靶基因对，构建"转录因子—增强子—靶基因"候选调控网络。
1. 全基因组TSS精确鉴定：在新生的RNA合成层面鉴定转录起始位点，不受RNA加工、剪接和降解的影响，是启动子图谱、可变启动子与启动子结构（核心启动子元件）研究的直接手段；
2. 增强子鉴定与eRNA起始位点解析：活跃增强子产生低丰度、稳定性差、典型双向转录的eRNA，常规RNA-seq难以捕获；PRO-cap可直接检测eRNA的精确起始位点，识别真正处于活跃状态的增强子；
3. 可变TSS解析：通过PRO-cap可精准鉴定同一基因的多个TSS以及不同TSS的比例，分析不同TSS使用比例以及刺激条件下TSS的转换情况；
4. 与PRO-seq联合解析转录周期：PRO-cap定位"起点"，PRO-seq追踪"进程"，二者联合可量化转录起始、启动子近端暂停、暂停释放、有效延伸与转录终止各环节，揭示基因表达调控发生在转录周期的哪一步。
1. 直接检测新生的加帽RNA，真实反映转录起始活性：不依赖成熟RNA的积累，避免稳态RNA干扰与转录后加帽背景，结果更接近实时的转录起始事件。
2. 单碱基分辨率、链特异性：reads的5′端即TSS，可分辨重叠基因、可变启动子的精细起始位置，并明确转录方向。
3. 背景极低、灵敏度高的eRNA检测：多轮链霉亲和素亲和富集累计约百万倍富集效率，有效清除未标记背景RNA，对低丰度、不稳定的增强子RNA高度敏感。
4. 物种适用范围广：已应用于人、小鼠、果蝇、线虫等多种体系。
1. 实验流程自主研发，特殊提核方式有效捕获新生RNA，PRO-cap与PRO-seq可平行建库、联合分析。
2. 不限物种及组织类型，非模式物种执行经验丰富，已开展包括人、鼠、猴子、牛、拟南芥、小麦、芒果、油松、鱼、虾、贝等十余种动植物项目。
3. 分析体系完善，涵盖TSS图谱、双向转录与调控元件鉴别、转录动力学及三元调控网络，提供全面的分析结果与多组学联合应用分析。
4. 文章级全流程服务，包括一对一方案讨论及制定、检测数据解读、个性化分析、验证方案、审稿意见回复等。
a. 组织或细胞液氮速冻后干冰寄送。
b. 不同类型样本推荐送样量如下：
动物组织： ≥100 mg
植物组织： ≥1 g
细胞： ≥1.0 x 10^5
Q1：PRO-cap与PRO-seq有什么异同？
相同点：两者同为精密核运行（Precision nuclear Run-On）新生RNA测序技术，由同一研究团队于2013年同期建立（Kwak et al., Science）；实验前期完全一致——细胞核分离、Biotin-NTPs核运行反应、链霉亲和素磁珠多轮富集；同为单碱基分辨率、链特异性、无需免疫沉淀的新生RNA检测技术，对低丰度、不稳定的转录本（如eRNA）均高度敏感。
不同点：
1. 测序端不同：PRO-seq对新生RNA的3′端测序，reads对应RNA聚合酶活性中心的位置，回答"聚合酶正在哪里转录"；PRO-cap对新生RNA的5′端测序且只捕获带帽RNA，reads对应转录起始位点（TSS），回答"转录从哪里开始"。
2. 5′端处理不同：PRO-seq将所有新生RNA去帽并磷酸化后连接5′接头，保证全部RNA均可被连接；PRO-cap先用5′-磷酸依赖性核酸外切酶降解未加帽RNA、再用碱性磷酸酶去磷酸、最后TAP/RppH去帽，仅原本带帽的新生RNA被接头连接。
3. 数据形态不同：PRO-cap信号高度集中于TSS，基因体信号接近背景水平；PRO-seq信号沿基因体连续分布，可观察暂停、延伸、终止等全程分布。
4. 处理环节不同：PRO-seq建库时需对新生RNA进行碱水解片段化；PRO-cap不经片段化，以保留完整的5′帽子信息。
简单理解：PRO-seq看"RNA聚合酶正在哪里转录"，PRO-cap看"每一次转录从哪里开始"。
Q2：PRO-cap一般怎么使用？
PRO-cap通常与PRO-seq联合使用：在同一份样本上平行建库，将转录周期"起始—暂停—延伸—终止"各环节量化。具体而言，PRO-cap提供每个转录事件的精确起始位点（TSS）；以TSS为锚点，利用PRO-seq计算启动子近端暂停峰的位置与强度，进而计算暂停指数（PI）并对基因转录状态分类；再结合PRO-seq在基因体下游及转录终止位点（TES）附近的信号，评估延伸速率、通读与终止效率，从而系统解析转录调控究竟发生在起始、暂停、释放、延伸还是终止环节。这也是PRO-seq/PRO-cap方法学文章中研究"启动子如何指导起始与暂停"的经典分析框架。
单独使用时，PRO-cap适合以"转录起始"为核心的科学问题，例如全基因组启动子图谱、可变启动子使用、增强子eRNA的起始位点鉴定、基因体内部隐秘转录（异常起始）事件检测等。
