rPRO-seq（rapid Precision Nuclear Run-On Sequencing，快速精准核运行测序）是在经典 PRO-seq 基础上升级而来的新生RNA高通量测序技术。它继承了 PRO-seq 单碱基分辨率、链特异性捕捉 RNA 聚合酶 II（RNAPII）实时转录位置的能力，能够揭示基因转录起始、暂停、暂停释放、延伸、终止等动态过程；同时通过预腺苷酰化接头（App-DNA）与二聚体阻断寡核苷酸（DBO）等创新设计，将建库时间由传统的 4-5 天缩短至约 12 小时（一天内完成），并将起始细胞量由 1,000 万-2,000 万个降低至最低 5,000 个。rPRO-seq 让稀有细胞类型、原代细胞及临床样本的新生转录组分析成为可能，是研究基因转录调控的强大工具。
rPRO-seq 与经典 PRO-seq 一样，是一种基于核运行实验（Nuclear Run-On）的高通量测序技术。核心原理是：在细胞核被分离并停止内源转录后，通过外源添加生物素标记的核苷酸（Biotin-NTPs），让原本就结合在 DNA 上的活跃 RNA 聚合酶继续延伸 1 个碱基，从而以单碱基分辨率标记出每个聚合酶的精确转录位置。在此基础上，rPRO-seq 对建库环节进行了系统优化：采用预腺苷酰化 3' 接头（P-3' App-DNA）在无 ATP 条件下完成连接，避免 RNA 自环化、多聚化等副反应；在 3' 接头连接后引入二聚体阻断寡核苷酸（DBO）与游离 3' 接头杂交，从源头消除接头二聚体；并利用磁珠上 5' 末端修复与柱式纯化替代反复酚氯仿抽提和乙醇沉淀，实现一天内完成建库。
实验流程：
1. 细胞核分离：对细胞或组织样本进行预处理，分离完整细胞核，尽量保留取样时的转录复合物状态，为核 run-on 反应提供稳定起始材料。
2. 核运行反应（Nuclear Run-on）：在分离的细胞核中加入 Biotin-NTPs，使正在延伸的 RNA polymerase 继续合成新生 RNA，并将生物素标记核苷酸掺入新生 RNA 链。
3. RNA 提取与片段化：采用柱式纯化法提取 RNA（免除 TRIZol 及酚氯仿抽提），随后进行片段化处理，为高分辨率定位做准备。
4. 新生 RNA 富集：利用链霉亲和素磁珠特异性富集带有生物素标记的新生 RNA，去除未标记 RNA，提高目标信号比例。
5. 3' 接头连接：使用预腺苷酰化单链 DNA 接头（P-3' App-DNA）与 T4 RNA ligase 2 truncated KQ 在无 ATP 条件下连接，仅允许接头 5' 端与新生 RNA 的 3'-OH 连接，避免 ATP 依赖的环化与多聚化副反应。
6. 磁珠上 5' 末端修复：利用 RppH 去除 5' 帽子结构并修复 5' 三磷酸，随后由 PNK 修复 5'-OH，使新生 RNA 具备连接能力。
7. DBO 杂交阻断：加入二聚体阻断寡核苷酸（DBO）与游离 3' 接头杂交形成双链，阻断其与 5' 接头的连接，从而消除接头二聚体（约 120 bp 的干扰条带）。
8. 5' RNA 接头连接与反转录：连接 5' RNA 接头后以 SuperScript III 进行反转录。
9. PCR 扩增与片段筛选：PCR 扩增获得 140-350 bp 文库，AMPure XP 磁珠进行片段筛选，免除测试 PCR 与 PAGE 切胶。
10.高通量测序与数据分析：对文库进行高通量测序，将 reads 比对至参考基因组，生成正负链新生转录信号图谱，并开展转录活性、eRNA、启动子暂停、差异转录等分析。
1. 转录活性分析：基于基因区域的新生 RNA 信号，评估不同样本或处理组之间的即时转录变化，筛选转录激活或抑制的基因，并进行差异分析、功能富集分析；
2. 调控元件分析：通过检测基因间区的新生 RNA 信号，识别活跃调控元件，并分析不同处理组之间的表达差异；
3. 转录动力学分析：分析 RNA polymerase 在基因体和终止区域的分布特征，评估暂停、暂停释放、转录延伸、终止以及共转录加工过程，揭示基因表达变化背后的转录动力学机制；
4. 分子调控轴解析：筛选具有调控关系的转录因子-调控元件、调控元件-靶基因、转录因子-靶基因对，构建"调控元件—转录因子—靶基因"的候选调控关系网络，深入解析核内转录调控机制。
1. 区分直接和间接转录响应：rPRO-seq 可直接检测正在发生的新生转录，适合用于观察处理后早期基因转录变化。相比普通 RNA-seq，更能区分基因是否被立即转录激活/抑制。
2. 增强子活性与 eRNA 检测：发现真正被激活的调控元件。活跃增强子常伴随 eRNA 产生，而 eRNA 通常丰度低、稳定性差、响应快，常规 RNA-seq 不易充分捕获。rPRO-seq 可通过新生 RNA 信号识别处于活跃状态的增强子区域。
3. 低起始量样本的新生转录组分析：rPRO-seq 最低仅需 5,000 个细胞，特别适合造血祖细胞、神经元、胚胎干细胞等难以大量获取的稀有细胞类型，以及患者来源的原代细胞、临床穿刺样本等珍贵有限样品，可支撑患者特异性的全基因组转录图谱研究。
4. 转录动力学分析：暂停释放、延伸与终止。rPRO-seq 可观察 RNA polymerase 在增强子、基因体和终止区域的分布，用于分析转录暂停与释放、有效延伸等过程。
5. 转录调控机制解析：同时检测转录因子、调控元件、靶基因的转录状态，构建"转录因子—调控元件—靶基因"的转录调控网络，深入解析核内调控机制。
1. 快速高效：约 12 小时完成建库，传统 PRO-seq 需 4-5 天，周期缩短 8 倍以上，显著降低批次间波动与 RNA 降解风险。
2. 超低起始量：最低仅需 5,000 个细胞，较传统 PRO-seq（需 1-2 × 10⁷ 个细胞）降低约 2,000-4,000 倍；25,000 个细胞即可获得与 1,000 万个细胞经典 PRO-seq 相当的数据质量。
3. 无接头二聚体干扰：App-DNA 预腺苷酰化接头 + DBO 二聚体阻断双重设计，从源头消除接头二聚体及自环化、多聚化等副产物，文库质量更高、连接效率更好。
4. 操作简便、样本损失少：免除多次酚氯仿抽提、乙醇沉淀、测试 PCR 和 PAGE 切胶，采用磁珠上反应与柱式纯化，减少样本损失和 RNA 降解。
1. 实验流程自主研发，特殊提核方式有效捕获新生RNA。
2. 不限物种及组织类型，非模式物种执行经验丰富，已开展包括人、鼠、猴子、牛、拟南芥、小麦、芒果、油松、鱼、虾、贝等十余种动植物项目。
3. 分析体系完善，包含基因活性、调控元件、转录动力学以及三元调控网络，提供全面的分析结果与多组学联合应用分析。
4. 文章级全流程服务，包括一对一方案讨论及制定、检测数据解读、个性化分析、验证方案、审稿意见回复等。
a. 组织或细胞液氮速冻后干冰寄送。
b. 不同类型样本推荐送样量如下：
动物组织： ≥100mg
植物组织： ≥1g
细胞： ≥1.0 x 10^5
Q1：rPRO-seq 和 PRO-seq 有什么区别？
rPRO-seq 与 PRO-seq 的核心原理完全一致：都基于核 run-on 反应，利用生物素标记的 NTPs 标记正在延伸的 RNA 聚合酶所对应的新生 RNA，都是单碱基分辨率、链特异性的新生 RNA 检测技术。二者区别主要体现在建库流程和适用范围上：
1. 建库效率：rPRO-seq 采用预腺苷酰化 3' 接头（P-3' App-DNA）在无 ATP 条件下连接，避免 RNA 自环化与多聚化；并在 3' 接头连接后引入二聚体阻断寡核苷酸（DBO），将游离的 3' 接头封闭为双链，消除接头二聚体。
2. 操作流程：rPRO-seq 用磁珠上 5' 末端修复和柱式纯化取代了传统 PRO-seq 的多次酚氯仿抽提、乙醇沉淀、测试 PCR 和 PAGE 切胶，整个流程可在约 12 小时内完成，而传统 PRO-seq 需要 4-5 天。
3. 起始量要求：传统 PRO-seq 需要 1-2 × 10⁷ 个细胞；rPRO-seq 最低仅需 5,000 个细胞，25,000-50,000 个细胞的结果即可与传统方法 1,000 万个细胞的结果相媲美。
4. 数据质量：在 HeLa 细胞中的平行对比显示，两种方法在启动子、基因体和增强子区域的信号谱、相关性及暂停指数均无显著差异，rPRO-seq 以更少的细胞和更短的时间获得了相当的数据质量。
简单理解：rPRO-seq 是"更快、更省样、更干净"的 PRO-seq，检测原理和结果解读与 PRO-seq 完全一致。
Q2：rPRO-seq 有哪些局限？
1. 低起始量下的分辨率限制：当细胞数低于 20,000 时，受基因组覆盖度和文库复杂度限制，对转录暂停、延伸、终止等 RNAPII 调控环节的精细刻画能力有限；即使提高测序深度，单碱基分辨率也会导致单个暂停位点的 reads 数偏少，灵敏度受限。该问题可以通过对多个暂停位点进行集合分析（ensemble analysis）部分缓解。
2. 仅捕捉活跃延伸的聚合酶：与经典 PRO-seq 一样，rPRO-seq 选择性捕获正在活跃延伸的 RNA 聚合酶，可能遗漏前起始复合物（PIC）和部分停滞的聚合酶。
3. 转录起始位点附近的检测盲区：高分辨率定位所需的短 run-on 片段导致 TSS 附近的聚合酶无法被完整检测——新生 RNA 过短时无法唯一比对到基因组，会在比对前被去除。
4. 结果受样本转录强度影响：不同实验条件和不同生物系统的整体转录输出强度不同，rPRO-seq 的特异性和灵敏性会随系统而变化，对转录水平极低的样本建议适当提高起始量。
